专利示意图
一、技术领域
分子克隆和基因编辑技术领域
二、专利介绍
1.专利信息
专利类型：发明
专利权人：清华大学深圳国际研究生院
申请号：202310380694.5
发明人：黄晶、维杰·潘迪、郝俊丞、黄鹏、林可、张熙、陈淑、罗贝·彼特
2.专利说明书摘要
本发明公开了一种基于人LDHA基因启动子区的双荧光素酶报告基因载体及其构建方法和应用，该双荧光素酶报告基因载体记为pGL3-LDHA-promote核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示，利用高效酶和同源重组原理，利用BgL II以及Hind Ⅲ 完成了LDHA基因启动子目的片段与pGL3-Basic线性化载体的克隆重组获得，双酶切的方法可以极大的降低载体的自连，提高重组载体的阳性率。pGL3-LDHA-promote可实现对LDHA启动子表达量进行敏感识别和准确的检测。
3.创新点
本发明属于分子克隆和基因编辑技术领域，涉及一种肿瘤代谢、肿瘤细胞能量供应相关基因靶点的重组质质粒，具体涉及一种含LDHA基因启动子和萤火虫荧光素酶报告基因的重组质粒及其构建方法和应用。
4.痛点问题
（1）本发明针对无法检测DNA甲基化所导致的mRNA表达水平变化，以及无法考察转录因子结合位点的问题，提供了一种有效解决方案；
（2）解决了检验成本高、设备制作困难的问题；
（3）解决了LDHA启动子序列GC含量高，难以使用特异性引物进行PCR扩增实验的问题；
（4）解决了DNA序列单酶切容易导致质粒载体自连的问题；
（5）解决了重组载体的阳性率低的问题。
5.技术优势
（1）使用利用高效重组酶和同源重组原理, 使用SE Recombinase联结到pGL3‑Basic质粒中，可以构建出较为精准的肿瘤细胞LDHA promoter活性检测敏感元器件；
（2）本方案转染实验简单，细胞生长时间短，能够有效节约检测成本；
（3）本发明针对无法检测DNA甲基化所导致的mRNA表达水平变化，以及无法考察转录因子结合位点的问题，提供了一种含LDHA基因启动子和报告基因的重组质粒，所述的重组质粒构建方法为：在pGL3 Basic质粒的多克隆位点使用同源重组的方式插入LDHA基因启动子序列；
（4） 本发明专利针对无法特异性对LDHA启动子表达量进行敏感识别的问题，提供了一种精准的双荧光素酶识别系统；
（5）LDHA启动子序列GC含量高，难以使用特异性引物进行PCR扩增实验，提出了一种高特异性的LDHA启动子序列引物设计方法；
（6）本发明针对DNA序列单酶切容易导致质粒载体自连的问题，利用高效重组酶和同源重组原理，提供了一种高效双酶切方法，可以实现若干（1-5）DNA碱基片段的无缝拼接。将LDHA基因启动子通过高效酶和同源重组原理，利用BgL2以及Hind Ⅲ 完成了LDHA基因启动子目的片段与pGL3-Basic 线性化载体的克隆重组，利用双酶切的方法可以极大的降低载体的自连，提高重组载体的阳性率。
三、产业化信息
1.应用场景
（1）作为肿瘤标志物的靶标筛查试剂盒，患者实现早期筛查；
（2）作为糖尿病患者血液标志物检测以及血糖干预等操作；
（3）广泛应用于基因调控研究领域；
（4）广泛应用于验证microRNA同mRNA靶向互作研究领域：将待测基因的3’UTR序列插入报告基因载体，再共转入该microRNA，检测荧光素酶活性下降，则提示为其靶序列；
（5）广泛应用于验证microRNA同lncRNA靶向互作领域：将待测lncRNA序列插入报告基因载体的3’UTR区域，检测荧光素酶活性；
（6）广泛应用于验证特定转录因子同其调控序列的作用：将该序列（通常为启动子区域）插入报告基因载体，同时在实验细胞中共转过表达该转录因子，可分析转录因子过表达是否提高萤光素酶活性；
（7）广泛应用于启动子结构分析：将启动子区域(约2k左右)进行分段截短或突变，构建入报告基因载体，检测荧光素酶活性；
（8）广泛应用于启动子SNP分析分析：一些基因的启动子区域存在单核苷酸多态性，可运用荧光素酶报告系统分析其相对活性；
（9） 验证信号通路是否激活：将该信号通路的下游相应原件序列构建入报告基因载体，检测不同上游条件下，其荧光素酶活性，即下游信号通路的响应情况；
（10）活体荧光成像：将荧光素酶基因整合到预期观察的细胞染色体DNA上以表达荧光素酶，培养出能稳定表达荧光素酶的细胞株，当细胞分裂、转移、分化时, 荧光素酶也会得到持续稳定的表达。基因、细胞和活体动物都可被荧光素酶基因标记。将标记好的细胞接种到实验动物体内后，当外源（腹腔或静脉注射）给予其底物荧光素(luciferin)，即可在几分钟内产生发光现象。
2.商业价值
此项技术拥有巨大的商业前景，对于生物医药行业有以下市场价值：
（1）2020年全球血糖监测设备市场规模为268亿美元，2015-20年复合增长率为9.0%；其预计2030年全球血糖监测设备市场规模达到738亿美元，2020-30年复合增长率为10.7%。而本敏感元器件可以在较低制作成本下，进行血液内LDHA（糖代谢关键基因）promoter活性的检测；
（2）生命科学是涉及生命和生物科学研究的科学分支，涵盖了免疫学、分子生物学、 细胞生物学、遗传学、医学、药学和生物化学等众多领域。生命科学试剂是生命科 学研究和开发的基础材料，作为易耗性工具在生命科学科研活动中被广泛使用。随 着生命科学研究逐步向微观化、定量化发展，新型的设备、试剂和实验方法也不断出现。生命科学试剂处于生物医药研发的上游，客户主要包括科研院校、制药企业及 CRO 公司、体外诊断试剂生产企业以及高通量测序服务企业。本发明可以提供一种成本低廉的LDHA promoter活性检测敏感元器件，能够广泛应用于科学研究与试剂检测。
3.发展规划
（1）该技术未来可应用至肿瘤标志物的靶标筛查试剂盒，实现肿瘤早筛试剂的国产化，快速提高我国在肿瘤筛查领域的水平；
（2）该技术能够通过推广试剂盒及测试耗材、水质检测相关技术服务及工程咨询等方式均可能占据较为广阔的市场。
4.合作方式
面议
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